Az allulóztermelés átfogó elemzése: áttekintés és frissítés
Allulose StoreForrás: mdpi.com
2024. augusztus 17.
1. Gabonatudományi és Technológiai Tanszék, Jiangsu Tudományos és Technológiai Egyetem, Zhenjiang 212100, Kína
2. Jiangsu Tartományi Gabona Biofeldolgozási Mérnöki Kutatóközpont, Zhenjiang 212100, Kína
3. Számítógépes Tanszék, Jiangsu Tudományos és Technológiai Egyetem, Zhenjiang 212100, Kína
Az elmúlt években jelentős előrelépések történtek a D-allulóz előállításában, különös tekintettel az enzimes konverziós módszerekre.
A legfontosabb fejlesztések közé tartoznak a hagyományos immobilizációs technikák, az új enzimek felfedezése, az irányított evolúciós vizsgálatok és a bioszintézis metabolikus útvonalak módosításán keresztül.
Az enzimatikus konverzió, különösen a D-allulóz-3-epimeráz felhasználásával, továbbra is alapvető fontosságú az ipari méretű termeléshez.
Az innovatív immobilizációs stratégiák, mint például a funkcionalizált nano-gyöngyök és a mágneses MOF nanorészecskék, jelentősen javították az enzimek stabilitását és újrafelhasználhatóságát.
Az irányított evolúció az enzimek termostabilitásának és katalitikus hatékonyságának javulásához vezetett, míg a szintetikus biológiai módszerek, beleértve a foszforilációvezérelt és termodinamikavezérelt útvonalakat, optimalizálták a termelési folyamatokat.
A nagy áteresztőképességű szűrőmódszerek kulcsfontosságúak voltak az enzimvariánsok azonosításában és finomításában az ipari alkalmazásokhoz.
Ezek a fejlesztések együttesen nemcsak a termelési hatékonyságot és a költséghatékonyságot növelik, hanem a fenntartható és gazdaságilag életképes gyártási gyakorlatokhoz is igazodnak.
Az elmúlt öt évben kritikus fejleményeknek lehettünk tanúi, amelyek jelentős potenciális hatással lehetnek az allulóz kereskedelmi életképességére és globális keresletére.
1. Bevezetés
Az allulóz, más néven pszikóz, egy ritka cukor, amely világszerte jelentős érdeklődésre tett szert alacsony kalóriatartalma és potenciális egészségügyi előnyei miatt, különösen a cukorbetegség és az elhízás kezelésében.
A fogyasztók egészséges étkezési szokásokkal kapcsolatos tudatosságának növekedése jelentősen megnövelte az allulóz iránti globális keresletet [ 1 , 2 , 3 , 4 ].
Észak-Amerika, különösen az Egyesült Államok, vezető szerepet tölt be a termelésben és a technológiai fejlesztésekben, olyan vállalatokkal, mint az Ingredion és a Tate & Lyle.
Az allulóz elterjedése különféle élelmiszer- és italtermékekben erőteljes volt, ami tovább gyorsította a keresletet [ 5 ].
Az Egyesült Államok mellett Japán és Dél-Korea is kiemelkedő piac, olyan vállalatokkal, mint a Matsutani Chemical és a CJ CheilJedang, amelyek úttörő szerepet játszanak az allulóz gyártásában és alkalmazásában [ 6 ].
Az allulóz előállítása kifinomult technológiákat igényel, elsősorban enzimes konverziót és szintetikus biológiát [ 7 , 8 , 9 , 10 ].
Az enzimes konverzió, amely specifikus enzimeket használ a fruktóz allulózzá alakítására, széles körben előnyös a magas hozam és hatékonyság miatt.
A fruktóz allulózzá alakításában a D-allulóz-3-epimeráz enzim vesz részt, amely megváltoztatja a fruktóz harmadik szénatomján lévő hidroxilcsoport konfigurációját, így allulóz keletkezik ( 1. ábra ) [ 11 , 12 ].
A fruktóz allulózzá alakításának aránya a termodinamikai egyensúly miatt körülbelül 30% marad.
A D-allulóz-3-epimeráz által katalizált enzimes reakcióban az előre (fruktózból allulózba) és a fordított (allulózból fruktózba) reakciók egyensúlyba kerülnek, és ezen az arányon stabilizálódnak [ 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 ].
Ez az egyensúly a reakció szabadenergia-tájképét tükrözi, ahol a fruktóz és az allulóz közötti energiakülönbség minimális. Így egyensúlyi állapotban az előre- és hátrameneti reakciósebességek egyenlőek, ami korlátozza a további átalakulást [ 14 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 ].
Ennek az akadálynak a leküzdéséhez innovatív megközelítésekre van szükség az egyensúly magasabb allulóz-hozam felé történő eltolásához.
A szintetikus biológia ígéretes megoldást kínál erre az egyensúlyi akadályra. A mikroorganizmusok genetikai módosításával az anyagcsere-útvonalak optimalizálása érdekében fokozható az átalakulási folyamat hatékonysága.
Ez a megközelítés az egyensúlyt az allulóz magasabb hozama felé tolhatja el, túllépve a természetes termodinamikai korlátokat [ 8 , 24 , 25 , 26 ].
- ábra. A reakció sematikus ábrázolása, ahol a D-fruktóz D-allulózzá alakul 3-epimeráz jelenlétében.
Jelentős előrelépés történt az allulóz szabályozási környezetében.
2019-ben az Egyesült Államok Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hivatala (FDA) elismerte az allulózt általánosan biztonságosnak (GRAS) minősített anyagként, felgyorsítva piaci elterjedését [ 27 ].
Olyan vállalatok, mint az Ingredion és a Tate & Lyle, megkapták a GRAS státuszt, amely lehetővé teszi a széles körű forgalmazást az Egyesült Államokban.
Az Európai Élelmiszerbiztonsági Hatóság (EFSA) szintén értékeli az allulóz Európai Unióban való alkalmazását, és a legújabb adatok pozitív eredményre utalnak [ 24 ].
Kína egyre jelentősebb szereplővé válik az allulóz piacán, a cukorfogyasztás csökkentésére és a közegészségügy javítására összpontosítva. A kínai vállalatok jelentős összegeket fektetnek be fejlett termelési technológiákba és bővítik kapacitásaikat, hogy kielégítsék mind a hazai, mind a nemzetközi keresletet.
A Baolingbao Biology Co., Ltd. (Yucheng, Kína) évi 5000 tonna termelési kapacitással rendelkezik, míg a Shandong Sanyuan Biotechnology és a CJ CheilJedang (Bingzhou, Kína) évi 3500, illetve 4000 tonna kapacitással járulnak hozzá jelentősen.
Ezek a több millió dolláros beruházások kiemelik elkötelezettségüket az allulóz iránti növekvő kereslet kielégítése iránt.
Kínában kritikus fontosságú volt a szabályozási támogatás. A Kínai Nemzeti Egészségügyi Bizottság (NHC) 2020-ban jóváhagyta az allulózt új élelmiszer-összetevőként, megkönnyítve annak beépítését az élelmiszerek szélesebb körébe [ 28 ].
Ez a szabályozási támogatás, Kína növekvő termelési kapacitásával kombinálva, várhatóan jelentősen csökkenti a termelési költségeket, és egy ritka cukoralternatíva biztosításával jelentősebben hozzájárul az emberi egészséghez.
Ezért át kell tekinteni az allulóz előállítási technológiájában és kutatásában elért legújabb eredményeket [ 6 , 17 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 ].
2. Legúǰabb eredmények
2.1. Enzimatikus átalakulás
A D-allulóz-3-epimerázt négy különböző szempontból kell tárgyalni: (1) Hagyományos módszerek, amelyek magukban foglalják az immobilizálást és a teljes sejtes fix katalízist nagyméretű termeléshez, (2) új enzimek felfedezése, (3) irányított evolúciós vizsgálatok, és (4) bioszintézis metabolikus útvonalak módosításával. Az enzimatikus konverzió továbbra is alapvető technológia az allulóz előállításához, különösen a fruktóz izomerizációja allulózzá specifikus enzimek, például a D-allulóz-3-epimeráz felhasználásával.
A piaci kereslet fokozatos bővülése miatt az új 3-epimeráz enzimek azonosítása, valamint az immobilizációs és szintetikus biológiai módszerek alkalmazása kritikus fontosságú stratégiák a jelenlegi ipari folyamatok fejlesztéséhez. Itt frissítettük az elmúlt öt év kutatási eredményeit, az enzimek aktivitásának és stabilitásának optimalizálására összpontosítva a konverziós hatékonyság növelése érdekében ( 1. táblázat ) [ 8 , 11 , 34 , 35 ].
2.1.1. Rögzítés
A nátrium-alginát, mint élelmiszeripari minőségű immobilizációs módszer, széles körben elterjedt az allulóz jelenlegi előállításában, de folyamatosan jelennek meg új módszerek, amelyek jelentős előrelépést jelentenek az enzimek stabilizálásában és hatékonyságában [ 36 ].
Például a D-allulóz D-glükózból történő biotranszformációját vizsgáló tanulmány, amely szimulált mozgóágyas kromatográfiával (SMBC) történő elválasztást és kristályosítással történő tisztítást is magában foglalt, lenyűgöző, 98%-os tisztaságú D-allulózt mutatott ki 70%-os hozammal [ 12 ].
Ez az integrált eljárás kihasználja az SMBC magas szelektivitását a D-allulóz hatékony elválasztására a reakcióelegyből, majd kristályosítással a nagy tisztaság elérése érdekében.
Az ilyen magas tisztaság és hozam elérésének képessége rendkívül vonzóvá teszi ezt az eljárást az ipari méretű termeléshez, biztosítva a hatékony konverziót és elválasztást.
További innováció tapasztalható a funkcionalizált polihidroxi-alkanoát (PHA) nano-gyöngyök stabil biokatalizátorként való alkalmazásában.
Ezeket a nano-gyöngyöket úgy tervezték, hogy immobilizálják a D-allulóz-3-epimerázt, ami fokozott enzimstabilitást és újrafelhasználhatóságot eredményezett.
Konkrétan, a PHA nano-gyöngyökön immobilizált enzim 10 használati ciklus után is megőrizte kezdeti aktivitásának 85%-át, szemben a szabad enzimmel, amely mindössze 5 ciklus után aktivitásának 50%-át elvesztette.
Ez a jelentős stabilitási és újrafelhasználhatósági javulás csökkenti a termelési költségeket és fenntarthatóbbá teszi a folyamatot. A funkcionalizált PHA nano-gyöngyök tartós platformot biztosítanak, amely minimalizálja az enzimek lebomlását, lehetővé téve a hosszabb távú felhasználást az ipari folyamatokban.
Ezenkívül a D-allulóz kétlépéses bioszintézise egy multienzimes kaszkádon keresztül a gyümölcslevek biokonverziójához demonstrálta a több enzim egyetlen folyamatban való kombinálásának lehetőségét [ 37 ].
Ez a módszer fruktóz-izomeráz és D-allulóz-3-epimeráz egymást követő alkalmazását foglalta magában, ami javította a D-allulóz-termelés összhatékonyságát és hozamát.
A tanulmány a D-fruktóz D-allulózzá történő 75%-os átalakulási arányáról számolt be, a kezdeti gyümölcslé-szubsztrátból számított összhozam 60%.
Ez a hatékony átalakítási folyamat különösen előnyös összetett szubsztrátok, például gyümölcslevek felhasználása esetén, az enzimes átalakítás minden egyes lépésének optimalizálásával.
A multienzimes kaszkád alkalmazásával ez a megközelítés magasabb összhozamot biztosít, és csökkenti a további feldolgozási lépések szükségességét, ezáltal egyszerűsítve a termelési folyamatot.
Végül, a D-allulóz-3-epimeráz mágneses fémorganikus váz (MOF) nanorészecskékbe történő rögzítése az enzimek rögzítésének élvonalbeli megközelítését képviseli [ 38 ].
Ezek a mágneses MOF nanorészecskék lehetővé tették az enzim egyszerű kinyerését és újrafelhasználását, jelentősen növelve a biokatalitikus folyamat hatékonyságát.
A tanulmány kimutatta, hogy az immobilizált enzim 15 ciklus után is megőrizte aktivitásának 90%-át, szemben a szabad enzimmel, amelynek aktivitása ugyanennyi ciklus után 40%-ra esett vissza.
Ezenkívül a MOF nanorészecskék nagy felületet biztosítottak az enzim rögzítésére, javítva az enzim stabilitását és aktivitását.
A nanorészecskék mágneses tulajdonságai megkönnyítették a reakcióelegyből való egyszerű elválasztást mágneses tér segítségével, így az eljárás rendkívül praktikus a nagyméretű biokatalízishez.
Ez az innovatív módszer nemcsak az enzimek teljesítményét javítja, hanem leegyszerűsíti a további feldolgozást is, ami kritikus fontosságú az ipari alkalmazások szempontjából.
Ezek a tanulmányok együttesen hangsúlyozzák az immobilizációs technikák jelentős előrelépéseit, amelyek javítják az enzimek stabilitását, újrafelhasználhatóságát és általános hatékonyságát a D-allulóz előállításában.
Az SMBC és a kristályosítás használata nagy tisztaságot és hozamot biztosít, így robusztus módszerré teszi az ipari alkalmazásokhoz.
A funkcionalizált PHA nano-gyöngyök fenntartható és költséghatékony platformot biztosítanak az enzimek immobilizálásához, meghosszabbítják az enzimek élettartamát és csökkentik a költségeket.
A többenzimes kaszkád megközelítés optimalizálja az átalakítási folyamatot, különösen az összetett szubsztrátok esetében, növelve az általános termelési hatékonyságot. A mágneses MOF nanorészecskék csúcstechnológiás megoldást kínálnak az enzimek kinyerésére és újrafelhasználására, javítva mind a stabilitást, mind az aktivitást.
Ezek az innovatív módszerek együttesen utat nyitnak a fenntarthatóbb és költséghatékonyabb ipari folyamatok előtt, végső soron hozzájárulva az egészségesebb allulóz alternatívák elérhetőségéhez és az ipari biotechnológia területének előmozdításához.
2.1.2. Új ipari enzimek vizsgálata
Az új ipari enzimek feltárása érdekében számos tanulmány a ritka cukrok előállításában kulcsfontosságú D-allulóz-3-epimerázok jellemzésére és fokozására összpontosított. Az Agrobacterium sp. ATCC 31749 rekombináns D-allulóz-3-epimeráza egy kritikus határfelületi aminosavat, a Lys-152-t tárt fel, amely elengedhetetlen a katalitikus aktivitáshoz, és amelynek mutációi 70%-kal csökkentik az aktivitást, ami betekintést nyújt az enzimtervezésbe [ 39 ].
Ez a megállapítás kulcsfontosságú, mivel alapot teremt annak megértéséhez, hogy az egyes aminosav-maradékok hogyan járulnak hozzá az enzim működéséhez, ezáltal irányítva a jövőbeni erőfeszítéseket a hatékonyabb és stabilabb enzimek ipari alkalmazásokhoz történő tervezésére.
A Bacillus sp. feltételezett Dolichol-foszfát-mannóz szintáza 35%-os átalakulási arányt mutatott D-fruktózról D-allulózra 50 °C-on, és 24 óra elteltével 80%-os aktivitást tartott fenn [ 40 ].
Ennek az enzimnek a kettős funkcionalitása, amely mind a D-allulóz 3-epimeráz aktivitást, mind a D-fruktóz D-allulózzá alakításának képességét mutatja, egyszerűsítheti az ipari termelési folyamatokat azáltal, hogy csökkenti a több enzim szükségességét. Ez a stabilitás és hatékonyság kulcsfontosságú azokban az ipari alkalmazásokban, ahol a folyamatos termelési folyamatok elengedhetetlenek, mivel potenciális költségmegtakarítást kínál, és egyszerűsíti a gyártási munkafolyamatokat.
Egy másik, a Bacillus sp.- ből származó D-allulóz-3-epimeráz figyelemre méltó hőstabilitást mutatott, 120 perces felezési idővel 70 °C-on, a D-fruktóz 30%-át D-allulózzá alakítva optimális 65 °C-os hőmérsékleten [ 10 ].
Az enzim magas hőmérsékleten való hatékony működési képessége különösen alkalmassá teszi olyan ipari alkalmazásokhoz, ahol a hőstabilitás kritikus tényező. Ez a tulajdonság csökkenti a hűtőrendszerek szükségességét, ezáltal csökkentve az energiaköltségeket és növelve a termelési folyamat általános hatékonyságát.
Az enzim magas hőmérséklet-tűrése lehetőséget nyit az olyan folyamatokban való alkalmazására is, ahol az alacsonyabb hőmérsékletek fenntartása nem lenne praktikus vagy költséghatékony.
Egy termikus vízi élőhely metagenomjából származó új D-allulóz 3-epimeráz gén, amelyet Bacillus subtilisben expresszáltak , 40%-os átalakulási arányt ért el D-fruktózról D-allulózra 60 °C-on.
Az enzim 48 óra folyamatos működés után is megőrizte aktivitásának 75%-át, ami robusztusságát és ipari felhasználásra való alkalmasságát jelzi [ 13 ].
A teljes sejtes katalízis alkalmazása tovább demonstrálja az enzim skálázható D-allulóz-termelésre való képességét, költséghatékony és eredményes módszert kínálva e ritka cukor előállítására.
Ez a megközelítés kihasználja a teljes sejtek természetes képességét komplex biokémiai átalakulások végrehajtására, egyszerűsítve a termelési folyamatot és potenciálisan csökkentve az enzimtisztítással és -stabilizálással kapcsolatos költségeket.
A Caballeronia fortuita D-tagatóz 3-epimeráza széles szubsztrátspecificitást mutatott, a D-fruktóz 25%-át D-allulózzá alakította 55 °C-on, 1,2 U/mg fehérje aktivitással [ 41 ].
A különböző szubsztrátokból származó különféle ritka cukrok előállítására való képessége leegyszerűsíti a termelési folyamatot és csökkenti a költségeket.
Ez a sokoldalúság értékes eszközzé teszi a Caballeronia fortuita enzimet azoknak az iparágaknak, amelyek költséghatékony módon kívánnak nagy értékű cukoralternatívákat előállítani. Az enzim széles szubsztrát-tartománya és a többféle cukor átalakításában való hatékonysága kiemeli a sokféle ipari alkalmazásban rejlő lehetőségeit, beleértve a ritka cukrok előállítását az élelmiszer- és gyógyszeripar számára.
A Christensenella minuta enzimje 32%-os konverziós arányt mutatott 50 °C-on, 150 perces felezési idővel, ami kiemeli a fenntartható cukortermelésben rejlő potenciálját [ 42 ].
Az enzim hatékonysága és mérsékelt hőmérsékleten való stabilitása alkalmassá teszi különféle ipari alkalmazásokhoz, beleértve az élelmiszer- és italgyártást is, ahol a termékminőség megőrzése érdekében az enyhe feldolgozási körülményeket részesítik előnyben.
Az enzim gyakorlati ipari körülmények közötti robusztussága azt sugallja, hogy minimális módosítással integrálható a meglévő termelési rendszerekbe, növelve a cukorgyártási folyamatok fenntarthatóságát és hatékonyságát.
Irányított evolúciós technikákat alkalmaztak a Clostridium cellulolyticum H10 D-allulóz 3-epimeráz termostabilitásának fokozására [ 43 ].
A továbbfejlesztett enzim felezési ideje 30 percről 180 percre nőtt 65 °C-on, és 45%-os D-fruktóz D-allulózzá konverziós arányt ért el.
Ezek a fejlesztések életképesebbé teszik az enzimet ipari alkalmazásokban, ahol gyakran szükség van a magas hőmérsékleten való hosszabb stabilitásra.
Az enzimtulajdonságok javítására szolgáló irányított evolúció alkalmazása rávilágít arra a lehetőségre, hogy az enzimeket az adott ipari igényekhez igazítsák, ezáltal optimalizálva a termelési folyamatokat.
Ez a megközelítés kiemeli a modern biotechnológiai módszerek erejét a speciális ipari alkalmazásokhoz igazított, továbbfejlesztett tulajdonságokkal rendelkező enzimek létrehozásában.
A Labedella endophytica hipertermosztabilis l-ribulóz-3-epimeráza 24 óra elteltével is megőrizte aktivitásának 90%-át 80 °C-on, 75 °C optimális hőmérsékleten [ 21 ].
Az enzim azon képessége, hogy ilyen körülmények között a D-fruktóz 28%-át D-allulózzá alakítja, aláhúzza a magas hőmérsékletű ipari folyamatokban rejlő lehetőségeit. Robusztussága ígéretes jelöltté teszi olyan alkalmazásokhoz, ahol szélsőséges körülmények állnak fenn, például bizonyos vegyi anyagok és gyógyszerek gyártása során. Az enzim magas termostabilitása azt jelenti, hogy olyan folyamatokban is használható, amelyek tartósan magas hőmérsékletet igényelnek, ami potenciálisan csökkenti a hűtési és stabilizációs lépések szükségességét, és ezáltal csökkenti a teljes termelési költségeket.
A Novibacillus thermophilus enzim 70 °C-on mutatott optimális aktivitást, és 12 óra elteltével is megőrizte aktivitásának 85%-át ezen a hőmérsékleten [ 44 ].
A D-fruktóz 38%-os átalakulását érte el D-allulózzá, ami igazolja hatékonyságát ipari méretű cukorszintézisben. Az enzim hatékonysága és termikus stabilitása különösen előnyössé teszi a D-allulóz előállításához olyan folyamatokban, amelyek hosszan tartó enzimaktivitást igényelnek.
Egy Corynebacterium glutamicumban található, élelmiszeripari minőségű expressziós rendszer elősegítette a nádmelasz D-allulózzá való átalakulását 42%-os konverziós hatékonysággal, aktivitásának 80%-át megtartva 24 óra elteltével [ 36 ].
Ez a rendszer fokozza az enzim termelését és alkalmazását az élelmiszeriparban, költséghatékony és skálázható módszert biztosítva a D-allulóz előállítására könnyen elérhető nyersanyagokból, például nádmelaszból. Ennek az innovációnak jelentős következményei vannak az élelmiszeriparra nézve, ahol egyre nagyobb az igény az egészségesebb allulóz-alternatívákra.
Az élelmiszeripari minőségű expressziós rendszer használatával ez a megközelítés biztosítja, hogy az előállított D-allulóz megfeleljen az élelmiszerekben való felhasználásra vonatkozó biztonsági és szabályozási szabványoknak.
Hasonlóképpen, a Sinorhizobium sp. D-tagatóz 3-epimeráza 55 °C-on 35%-os D-fruktóz D-allulózzá konverziós arányt ért el, aktivitásának 85%-át 24 óra elteltével is megőrizve [ 45 ]. Az enzim ilyen körülmények között mutatott robusztus teljesítménye arra utal, hogy ipari környezetben is alkalmazható, különösen ott, ahol folyamatos működés szükséges.
Végül a Thermoclostridium caenicola rekombináns D-allulóz-3-epimeráz 38%-os átalakulási arányt mutatott D-fruktózról D-allulózra 60 °C-on, és aktivitásának 80%-át megtartotta 24 óra elteltével [ 22 ]. Ezek az enzimek együttesen jelentős potenciált mutatnak nagyméretű termelési rendszerekbe való integrációra, ahol a hosszú távú állandó teljesítményük elengedhetetlen a folyamathatékonyság fenntartásához és a költségek csökkentéséhez, utat nyitva a D-allulóz szélesebb körű alkalmazásához különböző termékekben.
Ezek a tanulmányok együttesen rávilágítanak az enzimek jellemzésében, a termostabilitás javításában és a hatékony biokatalitikus alkalmazásokban elért jelentős előrelépésekre, amelyek előremozdítják a D-allulóz és más ritka cukrok ipari termelését.
Azáltal, hogy az ipari körülmények között nagy stabilitású és aktivitású enzimekre összpontosítanak, ezek a tanulmányok hatékonyabb és költséghatékonyabb termelési folyamatokhoz vezetnek, végső soron hozzájárulva az egészségesebb allulóz-alternatívák elérhetőségéhez.
1. táblázat. A 3-epimeráz tulajdonságaira vonatkozó legújabb tipikus kutatások.
2.1.3. Közvetlen evolúciós vizsgálat
A D-allulóz-3-epimeráz (DAEáz) fejlesztésében elért legújabb eredmények javították termostabilitását, katalitikus hatékonyságát és savállóságát, ami kulcsfontosságú az ipari D-allulóz előállításához [ 22 ].
Az irányított evolúció – az iteratív mutáció és szelekció módszere – alkalmazása bebizonyította, hogy az egyetlen aminosav-mutációk jelentősen javíthatják az enzim tulajdonságait. Amikor az egyetlen mutáció kudarcot vall, a semleges mutációk gyakran stabilizálják a fehérjét, lehetővé téve a későbbi előnyös változásokat, vagy megváltoztatva a „választott” funkciókat új képességek kifejlesztése érdekében.
Az irányított evolúció ezen ismereteit alkalmazták a DAEázra, ami az enzim teljesítményének javulásához és az alacsony kalóriatartalmú D-allulóz hatékonyabb, fenntarthatóbb ipari előállításához vezetett [ 48 ].
Irányított evolúció révén a Clostridium cellulolyticum H10 DAEáz mutánsai , mint például a D281G és a C289R, szignifikánsan megnövekedett felezési időt mutattak 65 °C-on, a tripla mutáns, az A107P/D281G/C289R 58,85-szeresére növelte a felezési időt és 14,39 °C-kal javította a termostabilitást [ 43 ].
Hasonlóképpen, számítógépes eszközök azonosították a Thermoclostridium caenicola DAEázban a hasznos mutációkat, aminek eredményeként létrejött a négypontos Var3 mutáns, amely fokozott merevséggel és stabilitással rendelkezik az új hidrogénkötéseknek és az optimalizált elektrosztatikus töltéseloszlásnak köszönhetően [ 49 ].
Egy szekvencia- és szerkezetalapú megközelítés azonosította a Thermogutta terrifontisból származó , nagymértékben termostabil TtDAE-t, az M4 variáns 5,12-szeresére növelte a katalitikus hatékonyságot és jelentősen magasabb olvadási hőmérsékletet mutatott [ 48 ]. A Clostridium bolteae DAEáz prolin aminosav-szubsztitúciói , különösen a Cb-51P/89P kettős mutáns, a felezési idő 2,32-szeres növekedéséhez vezettek 55 °C-on [ 50 ].
Továbbá, a savrezisztencia érdekében végzett mérnöki erőfeszítések eredményeként létrejött a tripla M3 mutáns (I114R/K123E/H209R), amelynek aktivitása 3,36-szorosára, savrezisztenciája pedig 10,6-szorosára nőtt 4,5 pH-n, így alkalmassá vált funkcionális lé előállítására [ 51 ].
A Halanaerobium congolense DAEáz racionális tervezése az Y7H/C66L/I108A és Y7H/C66L/I108A/R156C/K260C mutánsokat eredményezte, utóbbi 5,2 órás felezési időt mutatott 70 °C-on, olvadási hőmérséklete pedig 6,5 °C-kal nőtt [ 52 ].
Ezek a tanulmányok rávilágítanak a számítógépes előrejelzések és a kísérleti validálás közötti szinergiára, feltárva, hogy az enzimek stabilitásának és aktivitásának fokozása célzott genetikai módosításokon keresztül kulcsfontosságú az ipari alkalmazásokhoz. A prolinszubsztitúciók és diszulfidhidak alkalmazása a B-faktor analízissel kombinálva hangsúlyozza a fehérjedinamika megértésének fontosságát a hatékony enzimtervezés szempontjából [ 53 ].
A savrezisztens variánsok kifejlesztése tovább bővíti a DAEáz savas környezetben való alkalmazását, bemutatva az enzim sokoldalúságát és lehetőségeit.
Összességében ezek a kutatási erőfeszítések a DAEáz jelenlegi korlátait célozzák meg, és precedenst teremtenek a biokatalizátorok további optimalizálását célzó jövőbeli tanulmányokhoz, megnyitva az utat a biotechnológiában és azon túl is.
2.1.4. Szintetikus biológiai módszer
A hagyományos teljes sejtes katalízis jellemzően módosított Corynebacterium glutamicumot vagy Bacillus subtilis- t alkalmaz , és folyamatosan új anyagcsere-útvonalakat vizsgálnak [ 8 ].
Figyelemre méltóak az ATP metabolikus katalízisben való részvételével kapcsolatos legújabb kutatások, amelyek jelentős változásokat hozhatnak a szintetikus biológiai módszerekben.
A szintetikus biológiai módszerek növelhetik az allulóz konverziós arányát, és felboríthatják a fruktóz és az allulóz közötti egyensúlyt. A D-allulóz szintetikus biológiával történő előállítása jelentős érdeklődésre tett szert egészségügyi előnyei és gazdasági értéke miatt. Ez az elemzés három kiemelkedő módszert hasonlít össze: a foszforilációvezérelt termelést, a termodinamika-vezérelt termelést és a metabolikusan módosított Escherichia coli használatát , kiemelve azok integrált útvonalait és hatékonyságát [ 34 ].
A foszforiláció által vezérelt termelés az ATP regenerációs rendszerrel való összekapcsolódásával tűnik ki. Ebben a módszerben a D-glükóz enzimatikus lépések sorozatán keresztül D-allulózzá alakul. A kulcsfontosságú enzimek közé tartozik a hexokináz, amely a D-glükózt glükóz-6-foszfáttá foszforilálja, és a glükóz-6-foszfát-izomeráz, amely fruktóz-6-foszfáttá alakítja. A fruktóz-6-foszfátot a D-tagatóz-3-epimeráz tovább alakítja allulóz-6-foszfáttá, majd végül defoszforilálja D-allulózzá. Az ATP regenerációs rendszerében kreatin-kináz is részt vesz, amely segít fenntartani a magas ATP-szintet, növelve a termelési folyamat hatékonyságát és hozamát [ 54 ].
A D-allulóz D-fruktózból történő szintézisének egy rendkívül hatékony útvonala D-pszikóz epimerázt és L-ramnulóz kinázt használ, amelyek egy ATP regenerációs rendszerrel vannak integrálva polifoszfát kinázon keresztül ( 2. ábra ) [ 55 ].
Ez a módszer lenyűgöző, 99%-os konverziós arányt ér el a kulcsfontosságú reakciókörülmények optimalizálásával, az ATP-fogyasztás jelentős csökkentésével az elméleti mennyiség 10%-ára, és a polifoszfát gátlás mérséklésére egy szakaszos adagolási módot alkalmaz.
Hagyományosan a bórsavat használták a D-allulóz szintézis reakciójának előmozdítására a fruktózzal képezett komplexek révén, ezáltal az egyensúlyt az allulóz termelés felé tolva el ( 3. ábra ).
Azonban, míg a bórsav jelentősen növeli a konverziós hozamot a D-allulózhoz való magas kötődési affinitásának kihasználásával, környezeti és egészségügyi kockázatokat jelent toxicitása és a végtermékből való eltávolításának nehézsége miatt.
Ezzel szemben az enzimatikus megközelítés az enzimek természetes katalitikus hatékonyságát és az ATP regenerációs ciklusát használja ki a reakció fenntartható előmozdításához káros adalékanyagok nélkül.
Ez a fejlesztés kiemeli az anyagcsere-mérnökségben rejlő lehetőségeket az enzimek hatékonyságának és a gazdaságosság fokozására a biokémiai termelésben. Az ATP-regeneráció sikeres integrálása nemcsak a költségeket csökkenti, hanem kiküszöböli a bórsav szükségességét is, így a folyamat környezetbarátabb [56].
2. ábra. D-fruktóz D-allulózzá alakítása foszforilációs módszerrel.
3. ábra. A cukor-borát komplexek kémiai szerkezete. ( A ) Fruktóz β-d-fruktopiranóz cisz-C-4,5 diol-borátként. ( B ) Pszikóz α-d-furanopszikóz cisz-C-3,4 diol-borátként
3. Összefoglalás
Az allulóztermelés technológiai fejlesztései nemcsak a hatékonyság javítására összpontosítanak, hanem a környezeti és gazdasági aggályok kezelésére is.
A fenntartható termelési módszerek, mint például a megújuló alapanyagok használata és a zöld kémia alapelvei, beépülnek a termelési folyamatokba. Például a mezőgazdasági melléktermékek mikrobiális fermentáció szubsztrátjaként való felhasználása csökkenti a hulladékot és értéket ad az egyébként alacsony értékű anyagoknak.
Ezen fejlett termelési módszerek gazdasági elemzései kimutatták, hogy az enzimek teljesítményének optimalizálása és az integrált termelési rendszerek alkalmazása jelentősen csökkentheti az allulóz előállításának költségeit.
Ezek a költségcsökkentések kritikus fontosságúak ahhoz, hogy az allulóz versenyképes alternatívát jelentsen a piacon lévő hagyományos édesítőszerekkel szemben.
Az enzimes átalakítás, a szintetikus biológia és az integrált termelési rendszerek gyors fejlődése forradalmasítja az allulóztermelést.
Ezek a technológiák nemcsak az allulóztermelés hatékonyságát és skálázhatóságát növelik, hanem összhangban vannak a fenntartható és gazdaságilag életképes gyártási folyamatok felé mutató globális trendekkel is.
A jövőbeli kutatásoknak továbbra is az enzimek stabilitásának és aktivitásának javítására kell összpontosítaniuk fejlett fehérjetervezési technikák révén.
Ezenkívül az új mikrobiális gazdaszervezetek felfedezése és anyagcsere-útvonalaik optimalizálása tovább javíthatja a mikrobiális termelési rendszereket. A folyamatos termelési rendszerek integrációja és a hatékonyabb downstream feldolgozási technikák fejlesztése kulcsfontosságú lesz az allulóz kereskedelmi életképessége szempontjából.
Az ipar és az akadémiai szféra együttműködése elengedhetetlen ahhoz, hogy ezeket a technológiai fejlesztéseket gyakorlati alkalmazásokká alakítsuk.
Mindkét szektor szakértelmének és erőforrásainak kihasználásával lehetséges lesz leküzdeni az allulóztermelésben még fennálló kihívásokat, és teljes mértékben kiaknázni a benne rejlő lehetőségeket, mint egészséges és fenntartható cukoralternatívát.
4. Következtetések
Az allulóztermelés globális trendjét a fenntartható és hatékony bioalapú módszerek felé való elmozdulás jellemzi.
A kulcsszereplők fejlett technológiákba fektetnek be a termelési folyamatok optimalizálása érdekében, Kína pedig jelentős mértékben hozzájárul a K+F és a technológiai fejlesztésekbe történő beruházásaival.
Az ipar és az akadémiai szféra közötti együttműködés elengedhetetlen a termelési kihívások leküzdéséhez és az allulóz iránti növekvő globális kereslet kielégítéséhez.
A közelmúltbeli hatósági jóváhagyások, különösen az FDA általi és az EFSA várható jóváhagyása tovább növeli az allulóz piaci potenciálját, ami fényes jövőt jelez ennek az innovatív cukorhelyettesítőnek.
Ezenkívül a kínai Nemzeti Egészségügyi Bizottság közelmúltbeli jóváhagyása jelentősen növeli az allulóz hazai piaci potenciálját, támogatva integrációját az élelmiszerek széles skálájába, és összhangban a globális egészségügyi trendekkel.
